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Détermination des lipides par TLC
Une technique pour vérifier la composition des grasses est basée dans l'employ des plaques type Kieselgur-G, en employant comme phase movile éther du petroleum-éther ethylique-acide acétique (90:10:1). N'est pas facile definir la dilution des echantillons prés d'être injectée sur la plaque, mais ce dépendra de ce qu'on veut voir. C'est à dire, pour voir des tryglicerides, comme ils sont les components les plus abundants, la dilution sera mayeure que si on veut voir des autres components. L'echantillon doit être dissout dans una dissolvant organique. Si l'echantillon est aqueuse il faut faire un vortexé tres vigoreux  et de la centrifugation pour prend la fraction organique. Une fois developpée les plaques, le dissolvant  sur la plaque doit être évaporé avec de l'air chaud et elles doivrent être mises dans une solution du NaOH 0,01N (neutralisation de la matrix) par 1 minute. Alors, elles sont mises dans une solution du bleu du bromothymol (40mg dans 100ml) dans NaOH 0,01N (developpé des lipides) et elles sont mantenues pendant 1 heure. Les lipides se montrent comme des taches en bleu-vert (sauf des éxceptions) sur un fond blanc ou blanc-bleu. L'ordre de la migration de les differents components, de moindre a majeur Rf c'est:

phospholipides et les autre lipides polaires<monoacylglycerols<diacylglycerols<cholesterol (d'une cuoleur verte)<acides grasses (jeunes)<triacylglycerides<ésthers de l'acyle<ésthers du cholesterol (verts)

Teinture des gels de l'acrylamide avec du cuivre
Cést une teinture pue employée mais très effective, elle est plus sensible que les classiques avec bleu du coomasie quand est employée dans SDS-PAGE. Le Cu²⁺ forme des clusters avec le SDS, deviennant le gel une cuoleur bleue, et il forme aussi des clusters avec le SDS et les groups aminés des protéines, dans ce cas le gel reste incolore. Il s'agit d'une teinture negative, qu'elle doit être observée sur un fond noir. Il faut qu'on lave le gel avec de l'eau et le mettre dans une solution du clorure du cuivre 0.3M et lesser pendant demie heure. N'est pas necessaire de fixer les protéines, parce que les protéines forment des clusters avec la polyacrylamide et ça est sufficientpor les fixer. Une fois teinturé les gels ils doivrent être restés dans une solution aqueuse parce que si non, ils se séchent et la teinture se perde. Les protéines peut être récupèrées en lavant les gels avec EDTA.

Ce teinture peut être employée avec native-électrophoresis, dans ce cas les protéines restent bleus sur un fond bleu claire. le limit de la detection c'est, dans ce cas, similaire à ce de la teinture avec bleu du coomasie.

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Détermination des acides grass: Rodamine 6G
C'est méthode c'est basé dans la reaction du colorant rodamine 6G (forme basique) avec des acide grass. Le reactif Rodamine 6G c'est preparé en dissolvant 20mg de la Rodamine 6G dans 20ml du KH₂PO₄ 0.2M, pH 11 (ajouter avec NaOH). La forme basique de la Rodamine 6G se prends par agitation vigoreuse, dans l'obscurité, avec 200ml du Benzene spectral-grade. Quand les phases se dettachent, l'organique est décantée et elle est gardée à température ambiance et avec des pellets du NaOH (pour mantenir le pH) et en obscurité. La solution colorante obtenue (0.01%) est stable pendant 2 semaines.

Pour une perfecte realisation de l'assay c'est necessaire d'extraire les acides grass si on est dans une solution aqueuse en employant des dissolvants de haute purete. Une fois qu'ils sont extraits avec de la agitation vigoreuse (avec éther du petroleum nanograde ou reagent-grade, fraction 30-60º) et les phases sont séparées, on prends une fraction de ce dissolvant organique et c'est evaporé avec d'azote. Les acide grass sont assayes en assayant 1.5 ml de la solution de la Rodamine (préparer en mélangant des volumes egals du réactif rodamine et benzene spectral grade) et en mélangant doucement. Le colorant dilué est instable, c'est pour ça qu'on doit être mantenu concentré. 15 minutes plus tard à temperature ambiance, on mesure de l'absorbance à 515nm, en employant le reactif dilué comme de blanc. La couleur est stable pendant au moins 3 heures.
tote le material employé (des tubes et des cubettes en verre) est lavé avec de l'acide chromique, plusieurs fois avec de l'eau destillé, avec de l'ethanol et sechées. Ce nettoyée c'est critique: la rodamine teinture beaucoup les murs du verre contaminés avec du material organique.

Le spectrum du complex rodamine-acide linoleique dans du benzene a un point isosbestique à 495nm et un maximun à 515nm. Pour une quantité donnée de l'acide grass, l'absorbance sera 5 fois plus grand à 515 nm que à 535 nm. La linealité se mantiens entre 5-70nmol/ml. Les acidos grass à chaine longée avec des differents grades d'insaturation ont des patrons spectrophotometriques presque égals. L'oleate peut être un acide grass standar pour soit peu autooxydable.

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Détermination des prottéines: methode de Bradford
Le maximun d'absorbance du bleu de Coomasie dans solution acide est entre 495 a 595nm depuis d'avoir ajouté des protéines parce que la forme anionique est stabilisé par des interactions hydrophobiques et ioniques. Ce teinture réagit avec des restes de l'Arg et en moindre grade avec de l'His, Lys, Tyr, Trp et Phe. Il y a plusieurs des protocoles selon la quantité de la protéine à mesurer. Le réactif de Bradford se faire selon:

Dissoudre 100 mg de Coomasie blue G dans une mélange de 100ml d'acide phosphorique 85% et 50ml d'ethanol 95%. Dissoudre complétement la teinture et ajouter à 1 litre avec de l'eau destillée froide. Le reactif est stable à température ambiance depuis au moins 2 semaines.

 MÉTHODE 1,  0,2-20 µg protéina/ml.
Prendre dans des tubes des echantillons de 20µl. Ajouter 50µl du NaOH 1M. Le NaOH peut être mélangé avec du reactif (50µl/ml pour permettre un sole pipetté). Ajouter 1ml du reactif de Bradford. Incuber 5-30 minutes. Mesurer de l'absorbance à 595nm dans des cubettes du verre ou polyestirene.

MÉTHODE 2, 5-100µg protéine/ml.
Ajouter 200µl du reactif de Bradford avec du NaOH dans 800µl d'echantillon. Incuber 5-30 minutes. Mesurer de l'absorbance à 595nm dans des cubettes du verre ou polyestirene.

 MÉTHODE 3, 20-140µg protéine/ml.
Ajouter 5ml du reactif de Bradford avec du NaOH à 100µl d'echantillon. Incuber 5-30 minutes. Mesurer de l'absorbance à 595nm dans des cubettes du verre ou polyestirene.

Ce teinture tends à s'adherer a la suface des cubettes. Entre mesures les cubettes sont netoyées avec du methanol. Une fois finalisé l'assay elles sont lavées et pris dans HCl 0.1N pendant quelques heures, ou bien elles sont netoyent avec du détergent concentré et éclairsées avec de l'eau et acétone. Des hautes concentracions de la protéine se dettachent de la linealité; pour augmenter le range d'assay il est possible de travailler avec la différence A₅₉₅ - A₄₆₅. Quelques heures plus tard on peut voir un précipité; ce n'est pas un problème, on peut réaliser les mesures avec de son resuspension.

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Native-PAGE
Le système des buffers décrit à continuation c'est non denaturant: il ne contien pas  ni détergents ni d'autres agents denaturants, en plus, il est designé pour obtenir la plus grande résolution avec presque toutes les protéines. Préparer les suivantes solutions:
 

Buffer pour l'électrode inférior (+): (63 mM Tris, 0.5 N HCl, pH 7.47)  Tris, 22.7g  HCl 1N 150ml eau jusqu'à 3000ml	Solucions des monomères   Acrylamide-bisacrylamide:  @A) gel pour developpe (29.1% w/v acrylamide; 0.9% bis-acrylamide)  Acrylamide, 29.1g  bis-acrylamide, 0.9g  H2O  jusqu'à 100ml  @B) gel acinateur (6.25% T, 20% C)  Acrylamide, 5g  bis-acrylamide, 1.25g  eau jusqu'à 10ml
Buffer pour l'électrode superieur (-): (37,6mM Tris, 40mM Gly, pH 8.89)  Tris,  4.56g  Gly, 3g  eau jusqu'à 1000 ml	Persulfate amonique 10%  (NH4)2S2O8  1g  eau jusqu'à 10ml
Buffer pour le gel separateur (4X): (947 mM Tris, 0.289 N HCl, pH 8.48)  Tris,  11.47g  HCl 1N, 28.92 ml  eau jusqu'à 100 ml	TEMED
Buffer pour le gel acinateur (4X): (158 mM Tris, 0.256 N H3PO4, pH 6.9)  Tris,  1.92g  H3PO4 1 N, 25.6 ml  eau jusqu'à 100 ml	Solution coulorant de la saccharose: (saccharose 50%, bleu du bromophenol 0.1%)  Saccharose, 5 g  Bleu du bromophenol (1% w/v), 1ml  eau jusqu'à 1000 ml

 
Dans ce moment, pour préparer des gels avec des differents mesurée du pore compter sur ce table (les différents unités électrophoretiques ont des gels avec une déterminée taille, c'est pour ça que ces quantités varient avec les différents unités):

Quantités pour un gel de 1,5 mm d'épaisseur

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% acrylamide        7,5             10             15                  5                             3

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monomères.  3,8ml @A    5ml @A    7,5ml @A    2,4ml @A     10ml @B o 0,15ml @A

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eau                      8ml            6,8ml      4,3ml             10.8ml               /        o      10ml

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buffer                  3,75 ml tampón gel separador             5 ml tampón gel acinador

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                                                Degassifier pendant 10 minutes,

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TEMED                                 7,5µl                                               5µl

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(NH4)2S2O8                      50µl                                               17µl

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Préparer le gel separateur, mettre-le sans former des bulles dans le formateur des gradients.Vertir sur la surface une fine couche d'isobuthanol (il permit la polymerisation des monomères en evitant la diffusion de l'oxygène, qui est un inhibiteur de cette réaction) et attendre de la polymerization. Laver l'isobuthanol avec de l'eau et ajouter la sol. pour le gel acinateur. Prendre les peignes et attendre de la polymerisation.

Préparation des echantillons. Ajouter la concentration de l'echantillon à 2-10mg/ml. Mélanger un volumed'echantillon (dissolue dans 1/4 du buffer pour le gel acinateur + 3/4 H2O) avec 0.1 volumes de la solution teinture de la saccharose.

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