LOS ACARREADORES ANTIPARALELOS (ANTIPORTERS) EN LA TEORIA QUIMIOSMOTICA DEL METABOLISMO VECTORIAL

CAPITULO II

It was twenty years ago today,
Sgt. Pepper taught the band to play
They've been going in and out of style
But they're guaranteed to raise a smile.
So may I introduce to you
The act you've known for all these years,
Sgt. Pepper's Lonely Hearts Club Band,
Sit back and let the evening go.

John Lennon & Paul McCartney

LA TRANSLOCACION DE IONES Y LA TRANSFORMACION DE ENERGIA EN LA MITOCONDRIA.

La década que transcurrió de 1965 a 1975 fue testigo de los estudios que sacaron a la luz los principios fundamentales de la generación de energía en células de organismos eucariotes y procariotes. Gracias a la convergencia de herramientas y estrategias experimentales novedosas fue posible empezar a comprender los mecanismos físicos y químicos de los procesos de la transformación de energía y del transporte de iones en los seres vivos, así como las características moleculares de la composición y estructura de los constituyentes de las membranas transductoras.

El primer sistema biológico en el que se dilucidaron los cimientos en que se sustentan los procesos arriba señalados fue la membrana bacteriana (Mitchell y Moyle, 1967). A partir de entonces, los trabajos realizados en otras membranas biológicas transductoras de energía demuestran que la translocación de iones se encuentra acoplada de manera indisoluble a la transformación de energía. Además, han confirmado que el transporte iónico y la transformación de energía son dos componentes interconvertibles de un mismo proceso en todas las membranas biológicas que poseen la capacidad para conservarla.
Los antecedentes

Los trabajos realizados por Kalckar (1969) y Belitzer y Tsybakova (1939) -junto con los llevados a cabo previamente por Engelhardt, Meyerhoff, Wieland, Warburg y Lundsgaard (cf. Kalckar, 1969)- mostraron que:

1. Las enzimas del ciclo de Krebs, del transporte de electrones (e^-) y de la fosforilación oxidativa se localizan en las mitocondrias.

2. El proceso de acoplamiento energético se relaciona con dominios específicos del sistema multienzimático de transferencia de hidrógenos y e^- -cadena oxidativa- de la membrana.

3. La fosforilación oxidativa se puede llevar a cabo en partículas de mitocondrias (PSM) fragmentadas por digitonina o energía ultrasónica.

Con la asociación integral de estos hallazgos se hizo evidente que la energía también se puede utilizar en la cadena oxidativa mitocondrial, tanto para la síntesis de ATP, como para la realización de múltiples procesos que requieren energía, tales como la translocación de iones, la transhidrogenación y la transferencia reversa de e^- (Skulachev, 1971). Dicho de otro modo: la producción de ATP en las células es sólo uno de muchos procesos metabólicos en los que se puede emplear la energía que proviene de la respiración en los organismos quimiótrofos.

Una de las primeras hipótesis propuestas para explicar el mecanismo de acoplamiento entre la oxidación de los alimentos y la conservación de la energía biológica sugería que este proceso se realizaba por la acción de intermediarios químicos de "alta energía" (Slater, 1953). Estos debían ser generados por la transferencia de e^-, para luego utilizarse como precursores directos en la síntesis de ATP o en el transporte de iones. Esta hipótesis surgió del conocimiento existente sobre reacciones biológicas de oxidorreducción acopladas a reacciones de fosforilación, como la del gliceraldehido-3-fosfato, que son catalizadas por enzimas citoplásmicas de la vía de la glucólisis.

Sin embargo, a pesar de la aparición de algunas publicaciones que sugerían la existencia de intermediarios de "alta energía" (cf. Chance y cols., 1967; Racker, 1977), la búsqueda de tales moléculas altamente reactivas en la mitocondria "pronto tuvo que enfrentarse al fracaso y a la desilusión" (Estrada O., 1975). Esta crisis se originó con el anuncio de un enfoque conceptual totalmente diferente, conocido como hipótesis quimiosmótica (Mitchell, 1961). El planteamiento de dicha hipótesis (Mitchell, 1966; Mitchell, 1967; Mitchell, 1968) marcó -como reconocería posteriormente el mismo Mitchell (comunicación personal)- el descubrimiento del "Mundo Quimiosmótico" en la biología (Nicholls, 1982), así como el nacimiento de la bioenergética, como una rama altamente especializada de la bioquímica (Boyer, 1977), tal como la conocemos actualmente (Königsberg, 1991). Por otra parte, la ahora "Teoría Quimiosmótica" sentó las bases de la relevancia que, en la biología, tienen los fenómenos de superficies y la naturaleza vectorial de las reacciones bioquímicas que en ellas se llevan a cabo. La hipótesis postula:

1. No se pueden identificar ni aislar intermediarios químicos generados en la transferencia de e^- "simplemente porque dichos intermediarios no existen".

2. La matriz lipídica de la membrana proporciona una barrera impermeable a la translocación de iones, así como una organización topológica a los catalizadores en la matriz membranal que les permite transportar tanto e^- como iones dentro y a través de la membrana en forma vectorial.

3. La transformación de energía oxidativa en otras formas de energía se realiza, inicialmente, mediante la generación de una diferencia de potencial electroquímico transmembranal de iones hidrógeno (fuerza protomotriz). Esta fuerza es producto de la distribución asimétrica de protones (H⁺) a ambos lados de la membrana, al ser aquéllos translocados a través de ésta por los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria.

La fuerza protomotriz está formada por dos componentes íntimamente relacionados: uno, función de la diferencia de concentración química de hidrógenos a través de la membrana (un gradiente de pH) y otro, dependiente de la diferencia de carga eléctrica de iones H⁺ a ambos lados de la misma (un gradiente de potencial eléctrico). Esta relación se expresa

Dp = DY - Z DpH

donde Dp es la fuerza protomotriz, medida en unidades eléctricas, producida por el potencial electroquímico de H⁺, Y; Z es igual a 2.3 RT/F, donde R, F y T son las constantes de los gases, de Faraday y la temperatura absoluta del sistema, respectivamente. En los sistemas biológicos, en general, Z tiene un valor numérico cercano a los 60 mV.

4. Los gradientes de carga eléctrica y de potencial químico producen un campo en el que se ejerce una fuerza que tiende a atraer hacia el interior de la mitocondria a los protones previamente expelidos. Es el complejo enzimático de la ATPasa, el medio por el cual se cataliza la translocación termodinámicamente reversible de iones H⁺. Al mismo tiempo, la actividad química de los H⁺ a ambos lados de la membrana causa un cambio en la constante de equilibrio de la enzima, induciéndola a catalizar la síntesis de ATP o también, a crear las condiciones electroquímicas favorables para producir la translocación de otros iones diferentes a los H⁺.

En conclusión, mientras que en la antigua hipótesis química el transporte de iones (entre ellos los H⁺) era considerado sólo como una de múltiples consecuencias secundarias de la transducción de energía, en la hipótesis quimiosmótica la translocación de H⁺ es la causa, el evento primario, que al crear un puente termodinámico entre el sistema de transferencia de e^- y la ATPasa reversible, conduce a la transformación de energía en todos los seres vivos (Estrada O., 1975; Estrada O., 1983). Y no sólo eso, sino que en las membranas acoplantes, la energía de las oxidaciones o de la ruptura del ATP puede transducirse de forma reversible a la migración de H⁺ y otros grupos iónicos (Boyer, 1977).

Aunque de entrada la hipótesis quimiosmótica no tuvo una acogida muy positiva, la realización de profundos estudios experimentales a lo largo de más de una década, logró demostrar la veracidad de sus principios fundamentales. El mismo Racker (1974) llegó a considerar, seguro de que los postulados básicos de la hipótesis quimiosmótica son correctos, que el problema central de la fosforilación acoplada a la oxidación y el transporte de iones en la mitocondria había sido, al fin, resuelto.
Primeras evidencias del acoplamiento entre la translocación de iones y la transformación de energía en la mitocondria.

El postulado inicial de la hipótesis quimiosmótica señala que la fase lipídica de la membrana mitocondrial interna, posee una elevada capacidad dieléctrica, por lo que presenta una baja conductividad eléctrica y, por tanto, es impermeable al paso de iones, como H⁺, ^-OH, Na⁺, K⁺ y Ca²⁺.

En efecto, Mitchell y Moyle (1967) demostraron, mediante experimentos de transición de pulsos ácido-básicos que la fase lipídica de la membrana interna mitocondrial presenta una alta capacidad aislante. Esta misma propiedad se ha observado en membranas artificiales de fosfolípidos, así como en toda la gama de membranas conservadoras de energía, desde las de microorganismos fotótrofos y quimiótrofos hasta en las membranas fotosintéticas de los tilacoides de cloroplastos de plantas vasculares (Mitchell, 1967). Además se presenta tanto para los iones H⁺ como para K⁺ y Ca²⁺.

Ya que la membrana interna mitocondrial -en la que se localizan la cadena oxidativa y la ATPasa- es impermeable al paso de especies iónicas, resulta necesaria la existencia de dispositivos transportadores, embebidos en la matriz lipídica de la membrana, para catalizar tanto el movimiento específico de los iones H⁺, K⁺ y Na⁺, así como el paso de los diferentes aniones que participan en el metabolismo energético. Al respecto, la hipótesis quimiosmótica plantea:

1. La transferencia vectorial de H⁺ a través de la membrana lipídica es catalizada por una cadena oxidativa y por una ATPasa con distribuciones asimétricas.

2. El transporte de los iones Na⁺ y K⁺ a través de la membrana es facilitado por un acarreador que intercambia un H⁺ por cada catión metálico alcalino, sin alterar el potencial eléctrico mitocondrial.

3. Deben existir, además, otros sistemas independientes en la membrana, para llevar a cabo la catálisis de la transposición específica de iones como el Ca²⁺, el (PO₄)^3-, los nucleótidos y aniones carboxílicos que se requieren como metabolitos para el buen funcionamiento del ciclo de Krebs.

A pesar de que ya existían ciertos indicios, aunque escasos, que sugerían algún tipo de conexión del transporte de cationes monovalentes, divalentes y aniones con la oxidación de substratos y la hidrólisis de ATP (Harris y cols., 1966), resultaba complicado concebir la expulsión de H⁺ por parte de la mitocondria. Esta debía llevarse a cabo por medio de una secuencia alternada de enzimas membranales acarreadoras de hidrógenos -H⁺ y e^-- distribuidas asimétricamente a lo ancho de la bicapa lipídica.

Del mismo modo, no se entendía cómo un gradiente transmembranal de H⁺ -producto de la oxidación de sustratos del ciclo de Krebs- podía provocar el influjo de dichos iones de nuevo hacia el interior mitocondrial a través de una ATPasa asimétrica. Ni tampoco, cómo puede tal influjo de iones H⁺ utilizarse para catalizar la síntesis de ATP.

Por un lado, y en este orden de ideas, las investigaciones realizadas, tanto en mitocondrias intactas como en PSM, demostraron que la transducción de un par de e^- en la respiración produce el flujo transmembranal de dos H⁺, así como la hidrólisis de una molécula de ATP (Mitchell y Moyle, 1967; Mitchell y Moyle, 1968; Hinkle y Hortsman, 1971). Además, se encontró la existencia de una relación de dos iones H⁺ por cada átomo de oxígeno (Hinkle, 1973). Estos procesos efectivamente son catalizados por un conjunto de cinco complejos multienzimáticos, formados por conglomerados de metaloproteínas liposolubles (Hatefi, 1985). Los cinco complejos proteicos están localizados en la membrana interna mitocondrial y se distribuyen en una topología asimétrica específica a la función que cada uno de ellos desempeña en la transferencia de iones H⁺ y e^- (González Halphen, 1990) (Figura 2.1).

Figura 2.1. Estructura y función de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial.

Por otro lado, se han propuesto dos mecanismos por los cuales la ATPasa reversible sería capaz de utilizar el flujo de H⁺ para catalizar la síntesis de ATP:

1. El acoplamiento directo sugiere que los iones H⁺ que pasan a través del canal para H⁺ de la fracción liposoluble de la ATPasa se unen al (PO₄)^3- inorgánico (Pi); forman una especie activa que reacciona directamente con el ADP, dando como resultado el ATP (Vázquez Laslop y Dreyfus, 1989):

2. El acoplamiento indirecto (Figura 2.2) supone que el potencial electroquímico del H⁺ produce cambios conformacionales y de afinidad en los sitios de unión y catalíticos de la ATPasa (Vázquez Laslop y Dreyfus, 1989). Los primeros indicios sobre cambios conformacionales de proteínas relacionados con transducciones de energía biológica aparecieron publicados por Lumry desde 1963 (cf. Königsberg, M. 1991); se sugería que "las energías libres para la fosforilación son pequeñas y pueden ser fácilmente compaginadas por distorsiones menores de proteínas sin procesos mayores de desdoble." Posteriormente, en 1965 Boyer (cf. Estrada O., 1975) observó que la energía del transporte de e^- puede estar ligada a la formación de grupos tioéster por medio de cambios conformacionales de proteínas. Estos y otros hallazgos subsecuentes apuntaron hacia la existencia de un patrón universal en la función de los cambios conformacionales de proteínas vinculadas en las transducciones de energía biológica (Boyer, 1977).

Con estos resultados se pueden confirmar dos postulados fundamentales para sustentar los planteamientos básicos de la hipótesis quimiosmótica:

1. Los H⁺ son transferidos a través de la membrana mitocondrial, tanto por la actividad respiratoria como de ATPasa, en estequiometrías que están en completo acuerdo con el modelo de circuito de H⁺ (Mitchell, 1967).

2. La dirección de los flujos de H⁺ es controlada por el signo del potencial eléctrico de la membrana, que depende de la orientación topológica de los acarreadores respiratorios en la fase lipídica (cf. Mitchell, 1967).

Figura 2.2. Mecanismo de acoplamiento indirecto por cambios conformacionales y de afinidad en la ATPasa.

En este momento surge la necesidad de hacer una acotación importante: la topología asimétrica de las enzimas de la cadena respiratoria y la ATPasa reversible es esencial para la operación del proceso de fosforilación y de translocación de iones. Sin embargo, la oxidación es independiente de la topología de los complejos enzimáticos membranales (Estrada O., 1975).

Los estudios realizados en la década del 1970, a partir del descubrimiento de los antibióticos acarreadores de iones -de tipo acarreador móvil o ionóforo o de tipo túnel o canal- (Mueller y Rudin, 1969), demostraron fehacientemente que la translocación iónica que se lleva a cabo en la mitocondria tiene un comportamiento electroforético.

De este modo, los antibióticos acarreadores de iones aparecieron en la escena como la herramienta experimental más poderosa utilizada para hacer evidente tanto la naturaleza electroforética del transporte de iones, como la relativa independencia de los gradientes químico y de carga eléctrica transmembranal. Asimismo, los antibióticos ionóforos hicieron patente que la fuerza protomotriz depende de forma íntima de la anisotropía o lateralidad de la membrana en un sistema vesicular cerrado (Chance y Montal, 1971).

Los estudios realizados mediante la translocación de cationes monovalentes facilitada por antibióticos ionóforos, tanto en mitocondrias, cloroplastos y bacterias fotosintéticas (Greville, 1969) como en membrana celular de estreptococos sin fosforilación oxidativa (Harold y cols., 1970), mostraron que el potencial de membrana puede ser la fuerza motriz para realizar el trabajo del transporte de iones. Concluyendo: queda fuera de toda duda la existencia de un metabolismo vectorial en membranas que conservan energía, como un ejemplo fundamental en la biología de reacciones químicas espacialmente orientadas (Chance y Montal, 1971).
Los translocadores de iones de la membrana mitocondrial.

El empleo de los antibióticos ionóforos, así como la cuantificación isotópica, electroquímica y espectroscópica del flujo y recambio de iones en diversos sistemas experimentales, demostraron que la mitocondria realiza un bien definido proceso de transferencia de Ca²⁺. Este flujo iónico es catalizado por un acarreador específico (Vasington y Murphy, 1962; Carafoli y Sottocasa, 1974) que manifiesta un mecanismo electroforético de tipo uniporte para el Ca²⁺. El movimiento de Ca²⁺ es impulsado por el gradiente de potencial eléctrico producido, inicialmente, por la salida de H⁺ (Greville, 1969; Mitchell, 1967). Por otro lado, el uso de ionóforos de Ca²⁺ en membranas mitocondriales evertidas puso al descubierto la existencia de un mecanismo de transporte de tipo antiparalelo Ca²⁺/2H⁺, diferente al observado en membranas intactas (Estrada O. y cols., 1974a)

En este orden de ideas, es indispensable hacer mención del mecanismo de transporte de Na⁺ y K⁺ que experimentan las membranas mitocondriales.

Las evidencias previas sobre el funcionamiento de sistemas de bombas para cationes en diversas membranas celulares, hicieron natural sugerir la existencia de bombas de K⁺ o acarreadores en la mitocondria, dependientes de alguna forma de energía para su operación (Lardy y cols., 1967; Pressman, 1968).

Efectivamente, los estudios realizados en PSM, mediante la medición directa de flujos de cationes y H⁺ (Douglas y Cockrell, 1974), confirmaron la existencia de un translocador Na⁺,K⁺/H⁺, de tipo antiparalelo, eléctricamente silencioso, predicho previamente por Mitchell y Moyle (Mitchell, 1966). Al mismo tiempo, el ensayo de antibióticos altamente selectivos, como la monazomicina (Estrada O. y Gómez Lojero, 1971) y la bovericina (Estrada O. y cols., 1972), en mitocondrias intactas sugirió también la presencia de un intercambiador natural que cataliza el recambio electroneutro Na⁺>K⁺/H⁺ (Estrada O., 1974).

Con base en lo anterior, también se ha sugerido que el gradiente de pH existente a través de la membrana es la causa principal de la distribución y el flujo de metabolitos aniónicos entre la mitocondria y el citoplasma (Palmieri y Quagliariello, 1969), concebidos, éstos, como fases de un sistema termodinámico abierto. En tal sistema, la función principal que desempeñaría un acarreador antiparalelo catión/H⁺ activo sería generar gradientes transmembranales electroneutros de pH, regulados por su selectividad relativa para Na⁺ o K⁺ (Figura 2.3). Por lo tanto, el principal regulador de la velocidad y magnitud de la distribución de los metabolitos aniónicos entre la mitocondria y el citoplasma estaría representado por el mecanismo de translocador membranal de intercambio Na⁺>K⁺/H⁺ (Estrada O., 1974; Dubinsky y Cockrell, 1974). La función fisiológica que se ha asociado a este último acarreador es la de mantener el volumen homeostático de las mitocondrias y sus propiedades se han descrito sólo en mitocondrias intactas (Jezek y cols., 1990; Kakar y cols., 1989), además de operar como un autorregulador del pH interno de las células de los vertebrados mediante el intercambio de H⁺ intracelular por Na⁺ intramitocondrial (Figura 2.3), análogo al circuito quimiosmótico observado en membranas bacterianas (Maloney, 1992).

Figura 2.3. Intercambios iónicos en la membrana, asociados a la translocación catión/H⁺ a) mitocondrial; b) bacteriana.

Luego de todo lo expuesto hasta este momento, hace ya mucho que no existe otra alternativa que aceptar la antigua sugerencia de Racker (1974) de que el problema básico de la fosforilación oxidativa ya ha sido resuelto. La comparación de las propiedades de los translocadores modelo, como los antibióticos poliéteres carboxílicos, con las que se observan en translocadores proteicos por medio de técnicas de membranas modelo (Montal y Mueller, 1972) y de manipulación química (Montal, 1974) y genética (Martin y cols., 1984; Karpel y cols., 1988; Kakar y cols., 1989; Sardet y cols., 1989; Jezek y cols., 1990), han sido esenciales para comprender la naturaleza electroquímica del metabolismo energético.

Como se ha podido observar, los estudios existentes hasta el momento alcanzan a resolver el funcionamiento de los antiportes desde un punto de vista bioquímico. En el caso específico del antiporte Na⁺/H⁺ mitocondrial (Pouyssègur, 1985), el factor de crecimiento se une a un receptor específico que con ayuda de la proteína G activa a la fosfolipasa C, convierte al fosfatidilinositol-4,5-bifosfato a inositol-1,4,5-trifosfato; esto induce la unión de 1,2-diacilglicerol a la cinasa C, que a su vez aumenta el pH y dispara el antiporte Na⁺/H⁺ (Pouyssègur, 1985). Por otro lado, cuando aumenta la concentración de H⁺ en el citoplasma, se inicia una serie de reacciones para amortiguarlo. Entre éstas destaca el intercambio de H⁺ intracelular por Na⁺ externo, mediado por el antiporte Na⁺/H⁺, además de los sistemas amortiguadores tradicionales. Se cuenta también con información del comportamiento cinético de varias de las isoformas de la proteína acarreadora Na⁺/H⁺ (Levine y cols., 1993; Orlowski, 1993).

Aunque se ha dilucidado la secuencia de aminoácidos de algunas isoformas del antiporte Na⁺/H⁺, a través de estudios realizados con técnicas bioquímicas, de biología molecular y de simulación por medio de computadoras (Sardet y cols., 1989; Fliegel y cols., 1993; Orlowski, 1993), el mecanismo molecular preciso no se ha definido. Por ello, resulta de la mayor relevancia el identificar las bases moleculares de la dinámica de clatración y translocación de iones metálicos promovidas por acarreadores modelo, como los poliéteres neutros y carboxílicos. Todo esto, con la perspectiva de conocer los factores comunes a los eventos críticos del transporte o interacción iónica, los cuales puedan ser homólogos a los llevados a cabo por translocadores naturales en membranas biológicas, siempre dentro del principio de universalidad de las estructuras y los procesos.

Para explicar los procesos de transporte catalizado por poliéteres carboxílicos y su selectividad iónica, así como las interacciones que guardan con la membrana (tomada ésta como un todo, no fraccionaria), se ha considerado como aspecto importante, el análisis de modelos teóricos a partir de datos experimentales.

La visualización de estos fenómenos desde una perspectiva sistémica puede contribuir a explicar los procesos causales dentro del marco fenomenológico de las transformaciones de la energía biológica.

La correlación de modelos, tanto teóricos como experimentales, con observaciones biológicas de campo -en sistemas idóneos- tiene como objetivo último, el de ampliar el marco conceptual para llegar a plantear un modelo predictivo de la regulación de la translocación iónica dentro del metabolismo energético de los seres vivos.

© Raúl Alva*, México, Agosto de 1995.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.