Aislamiento de proteína de la leche



OBJETIVO.

Objetivo didáctico.
Observar el papel del pH isoeléctrico como medio para aislar una proteína especifica, en este caso la caseína de la leche.

Objetivo experimental. Agregar ácido clorhídrico a una muestra de leche para precipitar y separar la caseína.

INTRODUCCION.
Proteínas.



MATERIALES Y EQUIPOS.

___Agitador de vidrio 1
___Agitador magnético 1
___Balanza de dos platos 1
___Balanza granataria 1
___Botella lavadora 1
___Bureta graduada de 50 ml 1
___Electrodo para pH 1
___Embudo de talle largo 1
___Estufa 1
___Gradilla 1
___Matraz volumétrico de 100 ml 1
___Parrilla magnética 1
___Pinzas para bureta 1
___Pipeta serológica de 10 ml 1
___Pipeta serológica de 5 ml 2
___Potenciómetro 1
___Probeta de graduada de 25 ml 1
___Probeta de graduada de 100 ml 1
___Soporte universal 1
___Termómetro -10 a 200 °C 1
___Tubos de centrífuga de 50 ml 4
___Tubos de ensayo de 15 ml 4
___Vasos de precipitados de 30 ml 2
___Vasos de precipitados de 50 ml 1
___Vasos de precipitados de 100 ml 1
___Vasos de precipitados de 250 ml 2

REACTIVOS Y SUSTANCIAS.

___Acetona.
___Ácido clorhídrico al 20%. (50 ml)
___Bicarbonato de sodio.
___Etanol.
___Eter etílico.
___Leche en polvo descremada (PROPORCIONADA POR LOS ALUMNOS).
___Solución de pH 4.
___Solución de pH 7.

PROCEDIMIENTO.

Equipo de protección.
Ojos.
___Anteojos de policarbonato o monogógles.

Piel.
___Guantes de neopreno para ácidos.
___Ropa de algodón.

Respiratorio.
___Respirador con filtro para ácidos (Código amarillo).
___Maneje los ácidos en campana para vapores.
___No respire los vapores.

Precauciones especiales.
___Baño de ojos disponible.
___Regadera de seguridad disponible.
___Extinguidor de polvo químico, CO2 o gas halón (Tipo ABC).
___Lave abundantemente después de usar los reactivos.

Experimento.
___Colóquese ropa de algodón para protección (bata).
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los interruptores de luz del laboratorio estén encendidos.
___Revise que los extractores de aire estén encendidos.
___Revise que la estufa esté encendida a 40 °C.
Preparación de soluciones.
___Revise que la Acetona esté en la campana.
___Revise que el Ácido clorhídrico concentrado esté en la campana.
___Revise que el Agua destilada esté sobre la mesa.
___Revise que el Bicarbonato de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que el Etanol esté sobre la mesa.
___Revise que el Éter etílico esté en la campana.
___Revise que la leche en polvo esté sobre la mesa.
___Colóquese los guantes de neopreno.
___Lave el material con agua corriente y detergente.
___Enjuague el material con agua destilada.
___Seque el material con franela o con papel absorbente.
___Seque los guantes de neopreno con franela o con papel absorbente.
___Colóquese anteojos de policarbonato o monogógles.
___Conecte el electrodo para hidrógeno al potenciómetro.
___Conecte el potenciómetro al tomacorriente.
___Tome un vaso de precipitados de 30 ml.
___Etiquete el vaso de 30 ml con el nombre pH 4.
___Destape el frasco de solución pH 4.
___Vierta 10 ml de solución pH 4 en el vaso pH 4.
___Tape el frasco de solución pH 4.
___Tome un vaso de precipitados de 30 ml.
___Etiquete el vaso de 30 ml con el nombre pH 7.
___Destape el frasco de solución pH 7.
___Vierta 10 ml de solución pH 7 en el vaso pH 7.
___Tape el frasco de solución pH 7.
___Conecte la parrilla magnética.
___Coloque el vaso pH 7 sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso pH 7.
___Agite suavemente la solución en el vaso pH 7.
___Mida la temperatura de la solución pH 7 en el vaso.
___Verifique la temperatura en el potenciómetro.
___Descubra el bulbo del electrodo.
___Coloque el vaso de precipitados de 250 ml bajo el electrodo.
___Con la botella lavadora lave generosamente el electrodo.
___Seque al tacto con papel higiénico el electrodo.
___Introduzca el bulbo del electrodo para hidrógeno en el vaso pH 7.
___Cuide no golpear el electrodo con el agitador magnético.
___Coloque en "pH" el potenciómetro.
___Ajuste el pH del potenciómetro a 7 con la perilla "calibrar".
___Apague la parrilla magnética.
___Extraiga el electrodo para hidrógeno.
___Retire el vaso pH 7 de la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador magnético del vaso pH 7.
___Enjuague el termómetro, el espátula y el agitador con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Coloque el vaso de precipitados de 250 ml bajo el electrodo.
___Con la botella lavadora lave generosamente el electrodo.
___Seque al tacto con papel higiénico el electrodo.
___Coloque el vaso pH 4 sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso pH 4.
___Agite suavemente la solución en el vaso pH 4.
___Mida la temperatura de la solución pH 4 en el vaso.
___Introduzca el bulbo del electrodo para hidrógeno en el vaso pH 4.
___Cuide no golpear el electrodo con el agitador magnético.
___Coloque en "pH" el potenciómetro.
___Ajuste el pH del potenciómetro a 4 con la perilla "slope" (pendiente).
___Apague la parrilla magnética.
___Extraiga el electrodo para hidrógeno.
___Retire el vaso pH 4 de la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador magnético del vaso pH 4.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Coloque el vaso de precipitados de 250 ml bajo el electrodo.
___Con la botella lavadora lave generosamente el electrodo.
___Introduzca el electrodo en un vaso de 50 ml con agua destilada.
___Tome un vaso de precipitados de 100 ml.
___Etiquete el vaso de 100 ml con el nombre bicarbonato 10 %.
___Ajuste la balanza a 0.0 g.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la balanza.
___Tare el vaso bicarbonato 10 %.
___Destape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Tome un espátula.
___Pese 10 g de bicarbonato de sodio en el vaso bicarbonato 10 %.
___Tape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Limpie el espátula.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso bicarbonato 10 %.
___Con la probeta graduada mida 90 ml de agua destilada.
___Agregue los 90 ml de agua destilada al vaso bicarbonato 10 %.
___Agite vigorosamente para homogeneizar el bicarbonato de sodio.
___Apague la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador del vaso bicarbonato 10 %.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.

___Tome un vaso de precipitados de 100 ml.
___Etiquete el vaso de 100 ml con el nombre ácido clorhídrico 20 %.
___Con la probeta graduada mida 25 ml de agua destilada.
___Agregue los 25 ml de agua destilada al vaso ácido clorhídrico 20 %.
___Colóquese el respirador.
___Coloque dentro de la campana el vaso ácido clorhídrico 20 %.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % en la campana de extracción.
___Encienda la campana de extracción.
___Tome una pipeta serológica de 10 ml.
___Moje ligeramente el exterior de la boca de la pipeta serológica de 10 ml.
___Tome una propipeta.
___Inserte la boca de la pipeta serológica de 10 ml en la propipeta.
___Haga presión negativa en la propipeta.
___Destape el frasco de ácido clorhídrico 20 %.
___Dentro de la campana, mida _____ ml de ácido clorhídrico con la pipeta de 10 ml.
___Dentro de la campana, deslice el ácido clorhídrico en el vaso ácido clorhídrico 20 %.
___Tape el frasco de ácido clorhídrico 20 %.
___Enjuague la pipeta serológica de 10 ml con agua corriente.
___Retire la pipeta serológica de la propipeta.
___Iguale las presiones en la propipeta.
___Coloque el vaso ácido clorhídrico 20 % sobre la parrilla.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso ácido clorhídrico 20 %.
___Agite gentilmente para disolver el ácido clorhídrico.
___Agregue el resto del agua al ácido clorhídrico.
___Apague la parrilla magnética.
___Retire el vaso ácido clorhídrico 20 % de la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador del vaso ácido clorhídrico 20 %.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Verifique que la estufa esté a 40 °C.
___Arme el soporte universal con la bureta.
___Verifique que la llave de la bureta esté cerrada.
___Introduzca el embudo de talle largo en la bureta.
___Vierta el ácido clorhídrico 20 % en la bureta.
___Coloque el vaso de ácido clorhídrico 20 % bajo la bureta.
___Purgue la punta de la bureta.
___Afore la bureta.
___Tome un vaso de precipitados de 250 ml.
___Etiquete el vaso de 250 ml con el nombre leche.
___Con la probeta graduada mida 50 ml de agua destilada.
___En el vaso de 250 ml pese 15 g de leche.
___Agregue los 50 ml de agua destilada al vaso de la leche.
___Homogeinice la suspensión de leche.
___Vierta en el matraz volumétrico de 100 ml.
___Afore a 100 ml con agua destilada.
___Coloque la suspensión en un vaso de precipitados de 250 ml.
___Diluya la leche a la mitad con agua destilada.
___Tome un tubo de ensaye de 15 ml.
___Etiquete el tubo de ensayo con el nombre "leche".
___Tome una pipeta serológica de 5 ml.
___Con la pipeta mida 5 ml de leche.
___Vierta los 5 ml de leche en el tubo de ensayo "leche".
___Guarde los 5 ml a 4°C para medir la concentración de proteína.
___Coloque el vaso de la leche sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso de la leche.
___Agite gentilmente la suspensión de leche.
___Coloque la bureta sobre el vaso de la leche.
___Introduzca el electrodo en la suspensión de leche.
___Mida el pH y la temperatura inicial de la leche.
___Agregue HCl gota a gota hasta alcanzar pH de 4.8.
___Repose el precipitado de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.
___Homogeinice la suspensión.
___Apague la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador magnético.
___Enjuague y seque el agitador magnético con agua destilada.
___Tome los tubos para centrífuga.
___Distribuya la suspensión en los cuatro tubos de centrífuga.
___En la balanza de dos platos equilibre los tubos por parejas.
___Coloque encontrados los tubos en la centrífuga.
___Conecte la centrífuga.
___Encienda la centrífuga.
___Centrifugue a 1500 rpm durante 10 min.
___Apague la centrífuga.
___Desconecte la centrífuga.
___Tome un tubo de ensayo de 15 ml.
___Etiquete el tubo de ensaye con el nombre "sobrenadante".
___Tome una pipeta serológica de 5 ml.
___Con la pipeta de mida 5 ml del sobrenadante.
___Vierta los 5 ml de sobrenadante en el tubo "sobrenadante".
___Guarde los 5 ml a 4°C para medir la concentración de proteína.
___Deseche el resto del sobrenadante.
___Agregue 20 ml de agua destilada a cada tubo de centrífuga.
___Con el agitador de vidrio resuspenda el precipitado en cada tubo.
___En la balanza de dos platos equilibre los tubos por parejas.
___Coloque encontrados los tubos en la centrífuga.
___Conecte la centrífuga.
___Encienda la centrífuga.
___Centrifugue a 1500 rpm durante 10 min.
___Apague la centrífuga.
___Desconecte la centrífuga.
___Deseche el sobrenadante.
___Agregue 10 ml de etanol a cada tubo de centrífuga.
___Con el agitador de vidrio resuspenda el precipitado en cada tubo.
___En la balanza de dos platos equilibre los tubos por parejas.
___Coloque encontrados los tubos en la centrífuga.
___Conecte la centrífuga.
___Encienda la centrífuga.
___Centrifugue a 1500 rpm durante 10 min.
___Apague la centrífuga.
___Desconecte la centrífuga.
___Deseche el sobrenadante.
___Agregue 10 ml de acetona a cada tubo de centrífuga.
___Con el agitador de vidrio resuspenda el precipitado en cada tubo.
___En la balanza de dos platos equilibre los tubos por parejas.
___Coloque encontrados los tubos en la centrífuga.
___Conecte la centrífuga.
___Encienda la centrífuga.
___Centrifugue a 1500 rpm durante 10 min.
___Apague la centrífuga.
___Desconecte la centrífuga.
___Deseche el sobrenadante.
___Agregue 10 ml de éter etílico a cada tubo de centrífuga.
___Con el agitador de vidrio resuspenda el precipitado en cada tubo.
___En la balanza de dos platos equilibre los tubos por parejas.
___Coloque encontrados los tubos en la centrífuga.
___Conecte la centrífuga.
___Encienda la centrífuga.
___Centrifugue a 1500 rpm durante 10 min.
___Apague la centrífuga.
___Desconecte la centrífuga.
___Deseche el sobrenadante.
___Corte un cuadro de papel aluminio de 15 x 15 cm.
___Tare el cuadro de papel aluminio.
___Coloque el precipitado en un papel aluminio.
___Colóque el precipitado en la estufa a 40°C 10 min. (NO QUEMAR).
___Deje enfriar la proteína seca.
___Pese la proteína para calcular el rendimiento.
___GUARDE LA CASEINA SECA DEL PAPEL ALUMINIO A 4 °C EN UNA BOLSA .
___Neutralice lentamente los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Neutralice lentamente los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos orgánicos(ver Forma de desechar).
___Lave y enjuague el material.
___Seque el material con papel o con franela.
___Guarde y entregue el material y los equipos.
___Revise que no haya reactivos en la campana.
___Apague la campana de extracción.
___Revise que no haya reactivos sobre la mesa.
___Revise que la mesa esté limpia y seca.
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los extractores de aire estén apagados.
___Revise que los interruptores eléctricos del laboratorio estén apagados.
___Retírese el equipo de protección personal.
___Guarde el equipo de protección personal.
___Revise que la luz del laboratorio esté apagada.

Forma de desechar.
___Neutralice los residuos ácidos con bicarbonato de sodio.
___Neutralice los residuos alcalinos con bicarbonato de sodio. Deseche.


REFERENCIAS.
Plumer, D. T. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill, 1981.

Fisicoquímica del agua | Titulación de aminoácidos | Cuantificación de proteínas | Fisicoquímica de las enzimas | Cinética enzimática | Inhibición de enzimas | Análisis de carbohidratos | Análisis de lípidos

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© Raúl Alva*, México, 5/III/2001.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.