Cinética enzimática



OBJETIVO.

Objetivo didáctico.
Observar el comportamiento de una reacción enzimática en un extracto crudo vegetal.

Objetivo experimental. Obtener un extracto crudo de piruvicotransaminasa a partir de un producto vegetal para medir la actividad de transaminación de la enzima por colorimetría y determinar sus parámetros cinéticos.

INTRODUCCION.
Cinética enzimática
Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Aunque las reacciones enzimáticas obedecen a los mismos principios de la cinética química, se diferencian de éstas por el hecho de que las enzimas son saturadas por los substratos.
Durante una reacción enzimática, el substrato S se une químicamente a la enzima E para formar un complejo "enzima-substrato" (ES). Luego de sufrir varias reacciones químicas, el complejo ES se rompe para dar origen al producto P, liberando a la enzima E, que puede volver a iniciar otro ciclo catalítico.

E + S \=====\ ES \=====\ E + P


Se supone que estas reacciones son reversibles.
En 1913, Michaelis y Menten desarrollaron la teoría cinética general que explica el comportamiento de las reacciones enzimáticas.
Transaminasas
En el catabolismo de más de una docena de aminoácidos, el grupo alfa-amino es removido mediante catálisis enzimática. Ya que la reacción es una transaminación, las enzimas responsables son designadas como aminotransferasas o transaminasas. En esta reacción el grupo alfa-amino se transfiere al carbono alfa de un alfa-cetoácido, frecuentemente ácido alfa-cetoglutárico.
Algunos ejemplos de este tipo de enzimas son la aspartato aminotransferasa, la leucino transaminasa, la tirosina transaminasa y la alanina transaminasa que actúa en la catálisis de la reacción del presente experimento.



La actividad de la alanino transaminasa se determina por colorimetría midiendo la cantidad del alfa-cetoácido producido (ácido pirúvico), mediante la reacción estequiométrica con 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), que forma un compuesto colorido que tiene una absorción máxima Amáx a una longitud de onda de 505 nm.

MATERIALES Y EQUIPOS.

___Anillo de hierro 1
___Bisturí 1
___Botella lavadora de 500 ml 1
___Bulbo 1 ml para pipeta Pasteur 1
___Colorímetro 1
___Celdas de 1 cm 2
___Cristalizador 1
___Embudo de vidrio de talle largo 1
___Gasa (proporcionada por los alumnos) 4 cuadros de 10 x 10 cm
___Gradilla 1
___Hielo
___Mechero de bunsen 1
___Mezcladora 1
___Parrilla piromagnética 1
___Pipeta Pasteur 1
___Pipetas serológicas de 1 ml 4
___Pipetas serológicas de 5 ml 4
___Pipetas serológicas de 10 ml 2
___Probeta graduada de 50 ml 1
___Rejilla de asbesto 1
___Soporte universal 1
___Termómetro -10 a 200 °C 1
___Tubos de centrífuga 2
___Tubos de ensayo 20
___Tubo para homogeneizado 1 ó
___Mortero con mano 1
___Vasos de precipitados de 250 ml 2

REACTIVOS, SUSTANCIAS Y MATERIAL BIOLÓGICO.

___Chícharos frescos 10 g.
___Solución ácida de 2,4 dinitrofenilhidrazina 1.5 rnM
___Solución amortiguadora de TRIS-HCl 40 mM, EDTA 0.25 rnM pH 7.5
___Solución de NaOH 1 N
___Solución patrón de ácido pirúvico 2 mM
___Substrato: L-alanina 0.1 mM alfa-cetoglutarato 0.1 rnM, Tris-HCl 0.1 M pH 7.5

PROCEDIMIENTO.

Equipo de protección.
Ojos.
Anteojos de policarbonato o monogógles.

Piel.
Guantes de neopreno.
Ropa de algodón.

Respiratorio.
Respirador con filtro para ácidos (Código amarillo).
Maneje los ácidos y solventes orgánicos en campana para vapores.
No respire los vapores.

Precauciones especiales.
Baño de ojos disponible.
Regadera de seguridad disponible.
Extinguidor de polvo químico, bióxido de carbono o gas halón (Tipo ABC).
Lave abundantemente después de usar los reactivos.

Experimento.
___Colóquese ropa de algodón para protección (bata).
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los interruptores de luz del laboratorio estén encendidos.
___Revise que los extractores de aire estén encendidos.
___Revise que el Agua destilada esté sobre la mesa.
___Revise que el Bicarbonato de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que la solución de NaOH 1 N esté en la campana.
___Revise que la solución ácida de 2,4-DNPH esté en la campana.
___Revise que la solución TRIS-HCl, EDTA, pH 7.5 esté en la campana.
___Revise que la solución patrón de ácido pirúvico esté en la campana.
___Revise que la solución L-ala, alfa-cetoglutarato, Tris-HCl, pH 7.5 esté en la campana.
___Colóquese los guantes de neopreno.
___Lave el material con agua corriente y detergente.
___Enjuague el material con agua destilada.
___Seque el material con franela o con papel absorbente.
___Seque los guantes de neopreno con franela o con papel absorbente.
___Colóquese anteojos de policarbonato o monogógles.
Preparación de soluciones
___Tome un vaso de precipitados de 100 ml.
___Etiquete el vaso de 100 ml con el nombre bicarbonato 10 %.
___Ajuste la balanza a 0.0 g.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la balanza.
___Tare el vaso bicarbonato 10 %.
___Destape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Tome un espátula.
___Pese 10 g de bicarbonato de sodio en el vaso bicarbonato 10 %.
___Tape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Limpie el espátula.
___Conecte la parrilla magnética.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso bicarbonato 10 %.
___Con la probeta graduada mida 90 ml de agua destilada.
___Agregue los 90 ml de agua destilada al vaso bicarbonato 10 %.
___Agite vigorosamente para homogeneizar el bicarbonato de sodio.
___Apague la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador del vaso bicarbonato 10 %.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
Obtención de extracto crudo de enzima
___Coloque el tubo para homogeneizado o el mortero en una cama de hielo.
___Coloque dos tubos de ensayo en la cama de hielo.
___Con el bisturí pique finamente los chícharos.
___Coloque el picado en el tubo para homogeneizado o en el mortero.
___Agregue 20 ml de la solución TRIS-HCl 40 rnM pH 7.5.
___Homogeneice el picado manteniendo el tubo dentro del baño de hielo.
___Coloque el embudo dentro de un tubo de ensayo de la cama de hielo.
___Coloque 4 capas de gasa sobre el embudo.
___Filtre el homogeneizado a través de las 4 capas de gasa.
___Vierta el filtrado en un tubo de centrífuga.
___Centrifugue a 3500 rpm durante 5 minutos.
___Vierta el sobrenadante en un tubo de ensayo frío.
___Mantenga el tubo de ensayo en un baño de hielo.
Cinética de la transaminación
___En un vaso de precipitados de 250 ml prepare un baño a 37 °C.
___Arme el soporte universal con el anillo de hierro y la rejilla de asbesto.
___Ponga a hervir agua destilada en un vaso de precipitados de 250 ml.
___Tome 8 tubos de ensayo.
___Etiquete los tubos del 1 al 8.
___En el tubo No 8 agregue 1 ml de substrato.
___En el tubo No 8 agregue 0.2 ml de extracto.
___Hierva el tubo No 8 a baño de María durante 5 min.
___En los tubos del 1 al 7 agregue los reactivos en el orden de la siguiente tabla.



___Incube los 8 tubos 30 minutos a 37 °C.
___Detenga la reacción colocando los tubos en un baño de hielo
Curva de calibración y medición de actividad enzimática
___Tome 6 tubos de ensayo.
___Etiquete los tubos del 1 al 6.
___En los tubos del 1 al 6 agregue los reactivos en el orden de la siguiente tabla (Curva de calibración).



___Adicione a los 14 tubos 1 ml de 2,4-DNPH.
___Agite vigorosamente los tubos para obtener una mezcla homogénea.
___Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
___Agregue a cada tubo 5 ml de solución de NaOH 1 N.
___Agite vigorosamente cada tubo.
___Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
___Calibre a 505 nm el colorímetro a 0 de Abs con el tubo 1 de la curva de calibración.
___Lea la absorbencia a 505 nm de cada tubo.
Forma de desechar
___Neutralice lentamente los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Neutralice lentamente los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos orgánicos(ver Forma de desechar).
___Lave y enjuague el material.
___Seque el material con papel o con franela.
___Guarde y entregue el material y los equipos.
___Revise que no haya reactivos en la campana.
___Apague la campana de extracción.
___Revise que no haya reactivos sobre la mesa.
___Revise que la mesa esté limpia y seca.
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los extractores de aire estén apagados.
___Revise que los interruptores eléctricos del laboratorio estén apagados.
___Retírese el equipo de protección personal.
___Guarde el equipo de protección personal.
___Revise que la luz del laboratorio esté apagada.

Forma de desechar.
___Neutralice los residuos ácidos con bicarbonato de sodio. Deseche.
___Neutralice los residuos alcalinos con bicarbonato de sodio. Deseche.

OBSERVACIONES
___Grafique la cuva de calibración de A vs [ác. Pirúvico].
___Calcule la concentración de ácido pirúvico [ác. Pirúvico] obtenido con cada concentración de substrato [substrato].
___Calcule la velocidad inicial de la reacción enzimática:

v = micromoles de ácido pirúvico/min


y las unidades internacionales por mililitro:

u.i. = micromoles/ml min


___Elabore la gráfica de Michaelis de [substrato] vs [ác. Pirúvico] (micromoles/min).
___Calcule la Km y la Vmáx de la enzima.
___Interprete el significado de los valores de Km y de Vmáx.
___Explique el resultado obtenido en el tubo No 8 de la cinética.

REFERENCIAS.
Lehninger, A.L. 1975. Biochemistry.2nd ed. Worth Publ. Co., New York.
Plumer, D.T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill.
Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial Interamericana.

Fisicoquímica del agua | Titulación de aminoácidos | Aislamiento de proteínas | Cuantificación de proteínas | Fisicoquímica de las enzimas | Inhibición de enzimas | Análisis de carbohidratos | Análisis de lípidos

Hojas de Seguridad | Reglas en el Laboratorio | La Bitácora | Riesgos Ambientales 1 | Riesgos Ambientales 2 | Riesgos Generales | Riesgos en el Trabajo | Seguridad, Higiene y Capacitación

Guantes especiales | Guantes industriales | |

| |

Eres el visitante desde enero de 2001 | Firma el Libro de Visitantes Get your own FREE Guestbook from htmlGEAR Este es el Libro de Visitantes

© Raúl Alva*, México, 5/III/2001.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.